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Forschung

Metabolic regulation and engineering

Corynebacterium glutamicum ist ein apathogenes Bodenbakterium, welches weltweit zur biotechnologischen Produktion von Aminosäuren eingesetzt wird [1]. Hauptprodukte sind L-Glutamat (2,3 Millionen Tonnen/Jahr) und L-Lysin (1,1 Millionen Tonnen/Jahr). Daneben haben Forschungsarbeiten der letzten Jahre gezeigt, dass dieser Organismus auch als mikrobielle Zellfabrik für die Herstellung einer breiten Palette weiterer Produkte genutzt werden kann, wie z. B. organische Säuren, Diamine, Bioethanol, Biobutanol oder Proteine. C. glutamicum ist damit ein wichtiger Modellorganismus für die industrielle oder weiße Biotechnologie. Um Produktionsstämme rational mittels „metabolic engineering“ zu entwickeln, ist ein umfangreiches Wissen zum Stoffwechsel und dessen Regulation sowie zum Energiehaushalt erforderlich. Unsere Arbeitsgruppe hat sich zum Ziel gesetzt, Beiträge zu einem globalen, systemischen Verständnis der bakteriellen Zelle am Beispiel von C. glutamicum zu leisten und das generierte Wissen für die Anwendung in der industriellen Biotechnologie zu nutzen.

 

1. Regulation

1.1 Transkriptionelle Regulation durch Einkomponenten-Systeme

DNA-bindende Transkriptionsregulatoren kontrollieren die Transkription von einem oder mehreren Zielgenen in Abhängigkeit von einem spezifischen Signal. Neben den Zweikomponentensystemen (s. nächster Abschnitt), die in vielen Fällen eine Antwort auf extrazelluläre oder membranassoziierte Reize vermitteln, gibt es in C. glutamicum auch zahlreiche Einkomponenten-Transkriptionsregulatoren, die intrazelluläre Reize erkennen und als Antwort darauf die Transkription der entsprechenden Zielgene verändern. Einen Überblick über die von uns charakterisierten Transkriptionsregulatoren gibt Tab. 1. Zusammen mit anderen Arbeitsgruppen in Deutschland, Frankreich, Japan und Korea sollen in Zukunft alle Transkriptionsregulatoren von C. glutamicum funktionell charakterisiert werden.

 

Tab. 1: Transkriptionsregulatoren, die in unserer Arbeitsgruppe in den letzten Jahren charakterisiert wurden.

RegulatorFunktionLiteratur
ClgRAktivator der Clp-Protease sowie von DNA-Reparatur-Proteinen[2-4]
AcnRRepressor der Aconitase[5,6]
RipARepressor von wichtigen Eisenproteinen unter Eisenmangel[7]
DtxRGlobaler Regulator der Eisen-Homöostase[8]
GntR1/2Regulatoren des Gluconat-Katabolismus und der Glucose-Aufnahme[9]
RosRRegulator der Antwort auf oxidativen Stress[10]
MtrABZweikomponenten-System für Osmoregulation und Zellwandmetabolismus[11-13]
PhoRSZweikomponenten-System für die Regulation der Antwort auf Phosphatmangel[14,15]
HrrASZweikomponenten-System für die Kontrolle der Häm-Homöostase[16]
CitABZweikomponenten-System für die Kontrolle der Citrat-Aufnahme in die Zelle[17]

 

1.2 Transkriptionelle Regulation durch Zweikomponenten-Systeme

Bakterien sind in der Lage, sich rasch an veränderte Umweltbedingungen (Kohlenstoffquellen- und Sauerstoffverfügbarkeit, pH, etc.) anzupassen. Dabei müssen spezifische Informationen über die zelluläre Umgebung wahrgenommen, über die Membran in die Zelle übermittelt und eine Antwort ausgelöst werden. Diese extrazelluläre Signalerkennung und Weiterleitung erfolgt in Bakterien in vielen Fällen über Zweikomponenten-Signaltransduktionssysteme.

Im Genom von C. glutamicum sind 13 solcher Systeme kodiert (Abb. 1), wobei die Antwort in allen Fällen eine veränderte Genexpression ist. Inzwischen konnten wir vier dieser Zweikomponenten-Systeme eine Funktion zuordnen. Das CitAB-System aktiviert bei Anwesenheit von Citrat im Medium die Expression von zwei Citrat-Aufnahmesystemen, welche für das Wachstum mit Citrat als C-Quelle essentiell sind. Das PhoRS-System spielt bei der Adaption an Phosphatmangel-Bedingungen eine wichtige Rolle und das HrrSA-System ist an der Häm-Homöostase beteiligt. Das MtrAB-Zweikomponentensystem ist in Corynebakterien und Mykobakterien hoch konserviert und kontrolliert Gene, die bei der Antwort auf osmotischen Stress, bei der Zellwand-Homöostase und bei der Zellteilung eine Rolle spielen.

Picture of genomic regions of C. glutamicumAbb. 1. Genomregionen von C. glutamicum mit den 13 Zweikomponentensystemen. Die unterschiedlichen Farben der kodierten Proteine zeigen unterschiedliche Funktionen bzw. Lokalisationen an. Die Nummern der Genloci entsprechen denen des GenBank-Eintrages BX927147 [18]. put., putativ; Me, metal; assoc., associated; biosynth., biosynthesis; mech.-sens., mechano-sensitive; CoA, coenzyme A; transp., transporter.


1.3 Transkriptionelle Regulation des TCA-Zyklus

Viele industriell relevante Metabolite werden von Intermediaten des TCA-Zyklus abgeleitet (z. B. L-Glutamat und L-Lysin) oder sind selbst Zwischenprodukte dieses Zyklus (z. B. Succinat). Aus diesem Grund war die transkriptionelle Regulation dieses zentralen Stoffwechselweges von besonderem Interesse. Obwohl die TCA-Zyklus-Enzyme vermutlich unter allen Kultivierungsbedingungen in der Zelle vorkommen, konnten wir zeigen, dass die Expression vieler TCA-Zyklus-Gene einer komplexen Transkriptionskontrolle unterliegt. Sie erlaubt es der Zelle, die Aktivität der Enzyme sehr genau an die jeweils vorherrschenden Stoffwechselbedingungen anzupassen. Einen Überblick über den gegenwärtigen Wissensstand zur transkriptionellen Regulation der TCA-Zyklus-Gene zeigt Abb. 2. Unsere Gruppe hat die Regulation von gltA [19], acn [6,7,20] und sdhCAB [21] untersucht.

Picture of transcriptional regulation of the TCA cycleAbb. 2. Übersicht über die komplexe transkriptionelle Regulation des TCA-Zyklus sowie des Glyoxylat-Weges. Die Gene kodieren die folgenden Enzyme: gltA, Citratsynthase; acn, Aconitase; icd, Isocitrat- Dehydrogenase; odhA, aceF, lpdA, 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex; sucCD, Succinyl-CoA-Synthetase; sdhCAB, Succinat-Dehydrogenase; fum, Fumarase; mqo, Malat:Menachinon Oxidoreductase; aceA, Isocitratlyase; aceB, Malatsynthase. Die bekannten und experimentell bestätigten Transkriptionsregulatoren der einzelnen Gene sind dargestellt. Pfeile deuten eine Aktivierung und stumpf-endende Linien eine Repression der Transkription durch den entsprechenden Regulator an. Bekannte oder vorhergesagte Effektoren sind ebenfalls angegeben. Adaptiert von [22].


1.4 Posttranslationale Regulation durch kovalente Proteinmodifikation: Serin/Threonin-Proteinkinasen

Nicht nur die Regulation auf Transkriptionsebene kann eine entscheidende Rolle bei der Produktbildung spielen, sondern auch die Regulation durch kovalente Protein-Modifikationen. Wir haben in den vergangenen Jahren die Phosphorylierung von Serin-und Threonin-Resten analysiert [23,24]. C. glutamicum besitzt 4 Serin-/Threonin-Proteinkinasen (STPKs: PknA, PknB, PknG und PknL) und eine Phospho-Serin/Threonin-Proteinphosphatase (Ppp). Mit Ausnahme von PknG sind alle anderen STPKs sowie Ppp membranintegrale Enzyme (Abb. 3). Unsere Untersuchungen zu PknG haben gezeigt, dass diese Proteinkinase eine entscheidende Rolle bei der Regulation des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (ODHC) spielt, und zwar über das Targetprotein OdhI. Im unphosphorylierten Zustand bindet das 15-kDa OdhI-Protein mit sehr hoher Affinität (Kd ca. 15 nM) an die OdhA-Untereinheit von ODHC und inhibiert die Aktivität des Enzym-Komplexes. Dadurch wird die oxidative Decarboxylierung zu Succinyl-CoA im TCA-Zyklus reduziert und 2-Oxoglutarat verstärkt über die Glutamat-Dehydrogenase reduktiv zu L-Glutamat aminiert. Wird OdhI jedoch durch PknG an einem konservierten Threonin-Rest phosphoryliert, wird die Interaktion zwischen OdhI und OdhA und somit die Hemmung des ODHC-Aktivität verhindert (Abb. 3). Deletion des odhI-Gens führt zu einem C. glutamicum-Stamm, der unter Bedingungen, die normalerweise zur Ausscheidung von Glutamat führen (Biotin-Mangel, Zugabe von Penicillin, Zugabe von Tween-40 oder Zugabe von Ethambutol) fast kein Glutamat bildet. OdhI ist also essentiell für eine effiziente Glutamat-Produktion mit C. glutamicum. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass OdhI nicht nur durch PknG, sondern auch durch die drei anderen STPKs PknA, PknB und PknL phosphoryliert werden kann und somit in der Lage ist, verschiedene Signale zu integrieren. PknA, PknB und PknL besitzen eine extrazelluläre Domäne, die vermutlich der Reizerkennung dient, allerdings ist bisher nicht bekannt, um welche Reize es sich dabei handelt.

Posttranslational regulation of OdhlAbb. 3: Zusammenfassung der posttranslationalen Regulation von OdhI durch die Serin-/Threonin-Proteinkinasen PknA, B, G, L und die Phospho-Serin/Threonin-Proteinphosphatase Ppp und dessen Einfluss auf die Glutamatproduktion. OdhA, AceF und Lpd, Untereinheiten des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes; Gdh, Glutamat-Dehydrogenase; MscCG, Glutamat-Exporter.

2. Atmungskette und Bioenergetik

C. glutamicum ist ein fakultativ anaerober Organismus, der Sauerstoff oder Nitrat als terminale Elektronenakzeptoren verwenden kann. Allerdings ist das Wachstum unter anaeroben Bedingungen mit Nitrat sehr limitiert, da das gebildete toxische Nitrit nicht weiter umgesetzt werden kann. Das aerobe Wachstum mit Sauerstoff erlaubt dagegen die Bildung sehr hoher Biomasse-Konzentrationen. In Abb. 4 ist ein Schema der Atmungskette von C. glutamicum dargestellt [25]. Die Reduktionsäquivalente, die bei der Oxidation der Substrate entstehen, werden zunächst durch eine Reihe von Dehydrogenasen auf Menachinon übertragen. Die Reoxidation des Menachinols erfolgt aerob primär über den Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplex oder alternativ über eine Cytochrom-bd-Oxidase. Der Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplex wurde in unserer Arbeitsgruppe durch Co-Reinigung der beiden Komplexe nachgewiesen (Abb. 5) [26]. Eine Besonderheit ist, dass es neben Cytochrom c1 keine weiteren c-Typ-Cytochrome in C. glutamicum  gibt und das c1 zwei kovalent gebundene Häm-Gruppen trägt, von denen eine für den Transfer der Elektronen auf die aa3-Oxidase verantwortlich ist [27]. Während der Superkomplex vermutlich 6 H+/2 e- aus der Zelle nach außen transportiert, sind es bei der Cytochrom-bd-Oxidase nur 2 H+/2 e-. Durch Deletion der Cytochrom-bd-Oxidase kann die Effizienz der Atmungskette und damit ggf. auch die Produktbildung gesteigert werden, wie wir am Beispiel von Lysin zeigen konnten [28].

Picture of an overview on major components of the respiratory chain of C. glutamicumAbb. 4: Überblick über die wichtigsten Komponenten der Atmungskette von C. glutamicum.

Schematic representation of cytochrome bc1-aa3 supercomplexAbb. 5: Schematische Darstellung der Untereinheiten, der Kofaktoren, der Topologie, dem Elektronenfluss sowie der Beteiligung des Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplex am Aufbau des Protonengradienten. Schwarze Quadrate, Häm-Gruppen; schwarze Kreise, Kupferionen.



3. Stammentwicklung durch metabolic engineering

Das Wissen zum Stoffwechsel und seiner Regulation, das wir in den oben beschriebenen Arbeiten gewinnen, wird zur Entwicklung neuer oder optimierter C. glutamicum-Produktionsstämme durch metabolic engineering eingesetzt. Drei Beispiele sind im Folgenden dargestellt.  

3.1 Anwendung von „regulatorischem“ Wissen

Durch die Aufklärung des neuen Regulationsmechanismus zur Kontrolle der Aktivität des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (ODHC) durch das Inhibitorprotein OdhI und die Proteinkinase G (PknG) (Abb. 3) konnte gezielt ein C. glutamicum Stamm konstruiert werden, der eine verbesserte Glutamat-Produktion zeigt [29]. Dazu wurde das pknG-Gen im Genom von C. glutamicum deletiert. Dadurch liegt OdhI vermehrt unphosphoryliert vor und bindet somit verstärkt an die OdhA-Untereinheit von ODHC. Unter bestimmten Glutamat-induzierenden Bedingungen, wie z. B. Biotin-Mangel, war die Glutamat-Bildungsrate und der Glutamat-Titer in der DpknG-Mutante stark erhöht.

3.2 Anwendung von „bioenergetischem“ Wissen

Die Deletion der cydAB-Gene für die Cytochrom-bd-Oxidase in dem L-Lysin-Produzenten C. glutamicum MH20-22B hatte so gut wie keinen Einfluss auf die Wachstumsrate und die gebildete Biomasse, die Lysin-Syntheserate sowie der finale L-Lysin-Titer stiegen jedoch um etwa 12% [28]. Dieser Effekt scheint darauf zu beruhen, dass die Elektronen ausschließlich über den Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplex auf Sauerstoff übertragen werden und somit mehr Energie pro Glucose konserviert werden kann als bei gleichzeitiger Nutzung des Superkomplexes und der energetisch ineffizienten Cytochrom-bd-Oxidase. Dadurch steht mehr Glucose für die L-Lysin-Produktion zur Verfügung.

3.2 Anwendung von „metabolischem“ Wissen

Ein kritischer Faktor bei der L-Lysin-Produktion mit C. glutamicum ist die Bereitstellung von NADPH [30]. Neben den NADPH-generierenden Reaktionen im Zentralstoffwechsel besitzen viele Bakterien, nicht aber C. glutamicum, eine membranintegrale Transhydrogenase, die NADP+ zu NADPH reduziert bei gleichzeitiger Oxidation von NADH zu NAD+. Die dazu nötige Energie wird vom elektrochemischen Protonengradienten bereitgestellt. Um diese Möglichkeit der NADPH-Bereitstellung auch in C. glutamicum zu nutzen, wurde die heterologe Transhydrogenase PntAB aus Escherichia coli in dem L-Lysin-Produktionsstamm C. glutamicum DM1730 überproduziert. Dadurch stieg die L-Lysin-Konzentration in Abhängigkeit von der eingesetzten C-Quelle (Glucose, Fructose, Glucose + Fructose oder Saccharose) um 10-300%. Die Anwesenheit einer Protonengradienten-gekoppelten Transhydrogenase ist also eine effiziente Strategie, um die L-Lysin-Produktion mit C. glutamicum zu verbessern.

 

4. Literatur

1. Eggeling L, Bott M (2005) Handbook of Corynebacterium glutamicum. Boca Raton, FL.: CRC Press.

2. Engels S, Ludwig C, Schweitzer J-E, Mack C, Bott M, Schaffer S (2005) The transcriptional activator ClgR controls transcription of genes involved in proteolysis and DNA repair in Corynebacterium glutamicum. Mol Microbiol 57: 576-591.

3. Engels S, Schweitzer JE, Ludwig C, Bott M, Schaffer S (2004) clpC and clpP1P2 gene expression in Corynebacterium glutamicum is controlled by a regulatory network involving the transcriptional regulators ClgR and HspR as well as the ECF sigma factor sigmaH. Mol Microbiol 52: 285-302.

4. Russo S, Schweitzer J-E, Polen T, Bott M, Pohl E (2009) Crystal Structure of the Caseinolytic Protease Gene Regulator, a Transcriptional Activator in Actinomycetes. J Biol Chem 284: 5208-5216.

5. Garcia-Nafria J, Baumgart M, Bott M, Wilkinson AJ, Wilson KS (2010) The Corynebacterium glutamicum aconitase repressor: scratching around for crystals. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 66: 1074-1077.

6. Krug A, Wendisch VF, Bott M (2005) Identification of AcnR, a TetR-type Repressor of the Aconitase Gene acn in Corynebacterium glutamicum. J Biol Chem 280: 585-595.

7. Wennerhold J, Krug A, Bott M (2005) The AraC-type regulator RipA represses aconitase and other iron proteins from Corynebacterium under iron limitation and is itself repressed by DtxR. J Biol Chem 280: 40500-40508.

8. Wennerhold J, Bott M (2006) The DtxR regulon of Corynebacterium glutamicum. J Bacteriol 188: 2907-2918.

9. Frunzke J, Engels V, Hasenbein S, Gätgens C, Bott M (2008) Co-ordinated regulation of gluconate catabolism and glucose uptake in Corynebacterium glutamicum by two functionally equivalent transcriptional regulators, GntR1 and GntR2. Mol Microbiol 67: 305-322.

10. Bussmann M, Baumgart M, Bott M (2010) RosR (Cg1324), a hydrogen peroxide-sensitive MarR-type transcriptional regulator of Corynebacterium glutamicum. J Biol Chem 285: 29305-29318.

11. Brocker M, Bott M (2006) Evidence for activator and repressor functions of the response regulator MtrA from Corynebacterium glutamicum. FEMS Microbiol Lett 264: 205-212.

12. Brocker M, Mack C, Bott M (2011) Target genes, consensus binding site, and role of phosphorylation for the response regulator MtrA of Corynebacterium glutamicum. J Bacteriol 193: 1237-1249.

13. Möker N, Brocker M, Schaffer S, Krämer R, Morbach S, Bott M (2004) Deletion of the genes encoding the MtrA-MtrB two-component system of Corynebacterium glutamicum has a strong influence on cell morphology, antibiotics susceptibility and expression of genes involved in osmoprotection. Mol Microbiol 54: 420-438.

14. Kocan M, Schaffer S, Ishige T, Sorger-Herrmann U, Wendisch VF, Bott M (2006) Two-component systems of Corynebacterium glutamicum: deletion analysis and involvement of the PhoS-PhoR system in the phosphate starvation response. J Bacteriol 188: 724-732.

15. Schaaf S, Bott M (2007) Target genes and DNA-binding sites of the response regulator PhoR from Corynebacterium glutamicum. J Bacteriol 189: 5002-5011.

16. Frunzke J, Gätgens C, Brocker M, Bott M (2011) Control of heme homeostasis in Corynebacterium glutamicum by the two-component system HrrSA. J Bacteriol 193: 1212-1221.

17. Brocker M, Schaffer S, Mack C, Bott M (2009) Citrate utilization by Corynebacterium glutamicum is controlled by the CitAB two-component system through positive regulation of the citrate transport genes citH and tctCBA. J Bacteriol 191: 3869-3880.

18. Kalinowski J, Bathe B, Bartels D, Bischoff N, Bott M, Burkovski A, Dusch N, Eggeling L, Eikmanns BJ, Gaigalat L, Goesmann A, Hartmann M, Huthmacher K, Kramer R, Linke B, McHardy AC, Meyer F, Mockel B, Pfefferle W, Puhler A, Rey DA, Ruckert C, Rupp O, Sahm H, Wendisch VF, Wiegrabe I, Tauch A (2003) The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins. J Biotechnol 104: 5-25.

19. van Ooyen J, Emer D, Bussmann M, Bott M, Eikmanns BJ, Eggeling L (2011) Citrate synthase in Corynebacterium glutamicum is encoded by two gltA transcripts which are controlled by RamA, RamB, and GlxR. J Biotechnol 154: 140-148.

20. Emer D, Krug A, Eikmanns BJ, Bott M (2009) Complex expression control of the Corynebacterium glutamicum aconitase gene: Identification of RamA as a third transcriptional regulator besides AcnR and RipA. J Biotechnol 140: 92-98.

21. Bussmann M, Emer D, Hasenbein S, Degraf S, Eikmanns BJ, Bott M (2009) Transcriptional control of the succinate dehydrogenase operon sdhCAB of Corynebacterium glutamicum by the cAMP-dependent regulator GlxR and the LuxR-type regulator RamA. J Biotechnol 143: 173-182.

22. Bott M (2007) Offering surprises: TCA cycle regulation in Corynebacterium glutamicum. Trends Microbiol 15: 417-425.

23. Niebisch A, Kabus A, Schultz C, Weil B, Bott M (2006) Corynebacterial Protein Kinase G Controls 2-Oxoglutarate Dehydrogenase Activity via the Phosphorylation Status of the OdhI Protein. J Biol Chem 281: 12300-12307.

24. Schultz C, Niebisch A, Schwaiger A, Viets U, Metzger S, Bramkamp M, Bott M (2009) Genetic and biochemical analysis of the serine/threonine protein kinases PknA, PknB, PknG and PknL of Corynebacterium glutamicum: evidence for non-essentiality and for phosphorylation of OdhI and FtsZ by multiple kinases. Mol Microbiol 74: 724-741.

25. Bott M, Niebisch A (2003) The respiratory chain of Corynebacterium glutamicum. J Biotechnol 104: 129-153.

26. Niebisch A, Bott M (2003) Purification of a Cytochrome bc1-aa3 Supercomplex with Quinol Oxidase Activity from Corynebacterium glutamicum. J Biol Chem 278: 4339-4346.

27. Niebisch A, Bott M (2001) Molecular analysis of the cytochrome bc1-aa3 branch of the Corynebacterium glutamicum respiratory chain containing an unusual diheme cytochrome c1. Arch Microbiol 175: 282-294.

28. Kabus A, Niebisch A, Bott M (2007) Role of Cytochrome bd Oxidase from Corynebacterium glutamicum in Growth and Lysine Production. Appl Environ Microbiol 73: 861-868.

29. Schultz C, Niebisch A, Gebel L, Bott M (2007) Glutamate production by Corynebacterium glutamicum: dependence on the oxoglutarate dehydrogenase inhibitor protein OdhI and protein kinase PknG. Appl Microbiol Biotechnol 76: 691-700.

30. Kabus A, Georgi T, Wendisch V, Bott M (2007) Expression of the Escherichia coli pntAB genes encoding a membrane-bound transhydrogenase in Corynebacterium glutamicum improves L-lysine formation. Appl Microbiol Biotechnol 75: 47-53.



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