Detailanalysen wissenschaftlicher Fragestellungen sowohl an lebenden Zellen als auch an in vitro Systemen macht die Manipulation biologischer Systeme auf genetischer Ebene zu einem notwendigen Instrumentarium. Derartige Manipulationen erlauben es uns, einzelne Proteine innerhalb der Zelle gezielt zu markieren bzw. in seiner Expression zu reduzieren. Zu diesem Zweck verwenden wir ein breites Spektrum molekularbiologischer Techniken, die es uns ermöglichen, gewünschte DNA-Fragmente in vitro zu vermehren, zu verändern und in geeigneter Form wieder zusammenzusetzen. Schwerpunktmäßig erzeugen wir auf diese Weise DNA-Konstrukte von Fusionsproteinen, die die DNA-Information aus fluoreszenten Proteinen (grün fluoreszierendes Protein, GFP oder hc-red/ds-red) sowie dem Protein von Interesse kombinieren (Abbildung. 1). Derartige Konstrukte erlauben es uns in einer Vielzahl von tierischen Zellen, die Lokalisation und Dynamik von spezifischen Proteinen genau zu analysieren.
Abbildung 1: Vinculin, als Markerprotein für Adhäsionskomplexe, wurde über genetische Techniken mit dem grün fluoreszierenden Protein fusioniert und in tierische Zellen (Fibroblast) eingeschleust. In Analysen markiert das fluoreszente Signal die Position des Proteins Vinculin.
Gleichzeitig erlaubt uns die siRNA Technik temporäre Mutationen zu erzeugen. Mit Hilfe dieser Technik kann durch Verwendung kleiner RNA-Fragmente, die komplementär zu einer gezielten mRNA sind, die Expression des entsprechenden Proteins nahezu unterdrückt werden. Veränderungen z.B. in mechanischen Prozessen können so zeitlich sehr genau selbst bei lebensnotwendigen Proteinen analysiert werden und zusätzlich genau einem Protein zugeordnet werden.
Weiterhin sehr wichtig für unsere Forschung sind biochemische Präparationstechniken. Mit Hilfe dieser Techniken werden einzelne Proteine gezielt aufgereinigt und nachfolgend in in vitro Systemen eingesetzt. Bei den aufgereinigten Proteinen kann es sich sowohl um endogene (natürlich in der Zelle vorkommende) Proteine handeln als auch um solche, die heterolog in E. coli oder S. cerevisiae exprimiert werden. Letztere Proteine werden grundsätzlich zuvor gentechnisch verändert, meist um sie mit bestimmten Aminosäure-Markersequenzen zu versehen, die die Aufreinigung erleichtern bzw. erst ermöglichen. Die zur Anwendung kommenden Aufreinigungstechniken am Institut beinhalten säulenchromatographische Verfahren, im speziellen Anionen-, Kationen-Austauscher, Affinitätschromatographien sowie Größenauftrennungen. Diese Techniken werden sowohl an Einzelgeräten als auch an einem Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC, Äkta) Gerät der Firma Amersham durchgeführt. Aufgereinigte Proteine werden nachfolgend über SDS-Gelelektrophoresen bzw. Western-Analysen auf Reinheit bzw. Bindungsfähigkeit überprüft.
letzte Änderung 22.08.2008 | Sebastian Houben | Ausdrucken