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Superresolution Mikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie ist zu einer unverzichtbaren Methode in den Lebenswissenschaften geworden. Mit neuartigen Methoden aus dem Bereich der Superresolution Mikroskopie (PALM, STORM und dSTORM) wollen wir die Auflösungsgrenze für unsere zell- und neurobiologischen Fragestellungen soweit verbessern, dass Strukturen mit 20 nm Ausdehnung zu erkennen und zu unterscheiden sind.

Heutzutage werden in der Zellbiologie die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, Multiphoton- und Weitfeld-fluoreszenzmikroskopie benutzt. Diese Verfahren besitzen jedoch eine maximale optische Auflösung von 250 – 500 nm, während verschiedene Zellorganellen und andere zelluläre Strukturen (z.B. Vesikel) mit Abmessungen zwischen 20 bis 200 nm deutlich kleiner sind. Aus der Kombination von Einzelmolekülspektroskopie, dem Ausnutzen von Dunkelzuständen der Fluorophore und neuartigen Beleuchtungsmethoden entstanden in den letzten Jahren viele neuartige Methoden in der Fluorezenzmikroskopie , u.a. FIONA, PALM, STORM, dSTORM, STED, SIM, SPM, PAINT (siehe zum Beispiel [Heilemann2010; Shermelleh2010]), die unter dem Oberbegriff „Superresolution Mikroskopie“ zusammengefasst werden. Einige Methoden erreichen eine bessere Auflösung durch die Verringerung der Point Spread Function (PSF) der Abbildung im Mikroskop mit Hilfe komplexer optischer Anregungsoptiken (STED, SIM), die anderen durch die sequentielle Bestimmung der Position einzelner Fluorophore (PALM, SPM, dSTORM und andere). Die Genauigkeit der Positionsbestimmung einzelner fluoreszierender Moleküle liegt zwischen 1 und 100 nm, entscheidend bestimmt durch die Anzahl der detektierten Photonen pro Fluorophor. Typischerweise werden optische Auflösungen von 40-50 nm erreicht, in den besten Aufnahmen liegen sie bei 20 nm. Die einzelnen, nacheinander bestimmten Positionen aller Fluorophore im abgebildeten Teil der Probe, die zum Beispiel eine bestimmte zelluläre Struktur markieren, werden in einem Bild dargestellt. Man erreicht so fünf- bis fünfzehnfach genauere Abbilder der Zellstrukturen im Vergleich zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie.

Wir haben uns entschieden drei nahverwandte Methoden (PALM, STORM und dSTORM), die apparativ nahezu identische Anforderungen stellen, für fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen in unserem Labor zu etablieren. Alle drei Methoden nutzen fluoreszierende Proteine (PALM: Photoactivated Light Microscopy) beziehungsweise Fluoreszenzfarbstoffe (dSTORM, STORM: direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), die langlebige Dunkelzustände (OFF-Zustand) aufweisen. Das sind Zustände in denen entweder keine Absorption bei der Anregungswellenlänge erfolgt oder die Fluoreszenzquantenausbeute sehr niedrig ist. Während der Bildaufnahme befinden sich die meisten Fluorophore in OFF-Zuständen und nur wenige im fluoreszierenden ON-Zustand. Deren Fluoreszenz wird registriert und die Position jedes fluoreszierenden Moleküls bestimmt. Danach wird erneut eine kleine Zahl von Fluorophoren in den ON-Zustand überführt (aktiv (PALM, STORM) oder passiv (dSTORM)) und die Positionen dieser Moleküle wieder ermittelt. Diese Prozedur wird einige 1000- bis 10000-mal wiederholt. Das Superresolution Bild besteht dann aus der Gesamtheit aller bestimmten Fluorophor-Positionen. In dSTORM Experimenten wird die Lebensdauer des Dunkelzustandes ausschließlich durch die chemischen Eigenschaften der Meßpufferlösung reguliert und die Fluorophore kehren stochastisch in den ON-Zustand zurück. Im Gegensatz dazu werden in PALM und STORM Experimenten die Fluorophore durch eine weitere, andersfarbige Lichtquelle vom OFF- in den fluoreszierenden ON-Zustand überführt. Somit kann in allen drei Methoden die gewünschte kleine Anzahl von Fluorophoren im ON-Zustand erreicht werden.

Bei ersten PALM- und dSTORM-Messungen, die wir seit Mai 2009 an einem schon existierenden Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülsensitivität durchgeführt haben, konnten wir Zytoskelett- und Membranstrukturen mit Auflösungen von 60-100 nm aufnehmen. Gleichzeitig identifizierten wir eine Reihe von apparativen Schwachstellen, die die Auflösung, die Aufnahmegeschwindigkeit aber auch die Möglichkeit routinemäßiger Messungen stark einschränkten. Deshalb bauen wir seit Mai 2010 ein neues Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das speziell für die Anforderungen der Superresolution Mikroskopie konstruiert wird. Es ermöglicht die Benutzung von bis zu vier Lasern, einer variablen Vergrößerung und einer aktiven Positionsstabilisierung der Probe. Außerdem erlaubt es das Umschalten zwischen Weitfeld- und TIRF-Beleuchtung (basierend auf Totalreflexion).

Derzeitige Untersuchungsobjekte sind Rezeptoren und Ionenkanäle in der Plasmamembran sowie Proteine, die in Zellorganellen lokalisiert sind. In einigen Projekten arbeiten wir mit anderen Teilinstituten des ICS zusammen. Außerdem beschäftigen wir uns mit der Charakterisierung von verschiedenen PALM-fähigen fluoreszierenden Proteinen und dSTORM-geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen und weiteren technischen Verbesserungen des Superresolution Mikroskops (Mehrfarben- und 3D Superresolution Mikroskopie).


Publikationen zum Thema:


M. Heilemann „Fluorescence Microscopy beyond the diffraction limit“ (2010) Journal of Biotechnology 149:243-251

L. Schermelleh, R. Heintzmann, and H. Leonhardt „A guide to super-resolution fluorescence microscopy” (2010) The Journal of Cell Biology 190:165-175


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