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Forschungsgebiet

Unter dem Begriff Autophagie werden heute drei Degradationsmechanismen zusammengefasst (Makroautophagie, Mikroautophagie und Chaperon-vermittelte Autophagie), die allesamt im lysosomalen Kompartiment konvergieren, sich jedoch sowohl hinsichtlich der involvierten Strukturen als auch in ihrer Degradationskapazität deutlich unterscheiden. Der ursprünglich beschriebene und quantitativ dominierende Prozess ist die Makroautophagie, meist kurz als Autophagie bezeichnet. Die Makroautophagie spielt nicht nur eine entscheidende Rolle für das Überleben von Zellen unter Hungerbedingungen, sondern ist gleichzeitig der bedeutendste Mechanismus für die Elimination langlebiger Makromoleküle und ganzer Organellen. Die abzubauenden Strukturen werden dabei in Doppelmembran-Vesikel (Autophagosomen) eingeschlossen, die später mit dem lysosomalen Kompartiment fusionieren. Zur Ausbildung dieser Organellen werden u.a. ubiquitinartige Proteine der Atg8-Familie benötigt, die enzymatisch an Membranlipide gekoppelt werden. Während die Hefe S. cerevisiae nur einen einzigen Vertreter dieser Familie exprimiert (Atg8 selbst), enthalten humane Zellen mehrere Homologe, z.B. das GABAA-Rezeptor-assoziierte Protein (GABARAP).

Weiergräber 2NMR-Strukturfamilien von GABARAP (links) und Atg8 (rechts). α-Helices sind in orange, β-Faltblätter in blau dargestellt.

Unsere Gruppe gehörte zu den ersten, die die Lösungsstruktur des humanen GABARAP and des Atg8 der Hefe mittels NMR-Spektroskopie bestimmen konnten (Abb. 1). Beide Moleküle zeigen im Kern ein β-grasp-Faltungsmotiv, das für Mitglieder der Ubiquitin-Superfamilie charakteristisch ist; dieses besteht aus einem zentralen viersträngigen β-Faltblatt mit zwei α-Helices auf dessen konkaver Seite. Eine Besonderheit der Atg8-Familie ist die N-terminale Verlängerung durch zwei zusätzliche α-Helices, die an der konvexen Seite des Faltblattes lokalisiert sind. Diese N-terminale Subdomäne zeigt beim Atg8 starke konformationale Flexibilität auf der Mikro- bis Millisekunden-Zeitskala (Abb. 1, rechts). Im Unterschied dazu ist beim GABARAP die Struktur des N-Terminus deutlich besser definiert (Abb. 1, links).
Das Screening phagenbasierter Peptidbibliotheken lieferte einen Einblick in die Ligandenspezifität von GABARAP; mit den daraus gewonnenen Konsensusmotiven konnten schließlich potentielle physiologische Bindungspartner aus Sequenzdatenbanken extrahiert werden. Dazu gehören beispielsweise Calreticulin und die schwere Kette von Clathrin. Wir haben den Modus der Ligandenbindung durch GABARAP intensiv untersucht, u.a. anhand der Kristallstrukturen von Komplexen mit artifiziellen und Calreticulin-Peptiden (Abb. 2). In allen Fällen wurde die Interaktion durch zwei hydrophobe Taschen (hp1, hp2) auf der Oberfläche des GABARAP-Moleküls vermittelt, die ein Motiv der Form WxxΦ (Φ = hydrophobe Seitenkette) zu binden vermögen.

Weiergräber 3Kristallstrukturen von GABARAP im Komplex mit einem artifiziellen Liganden (K1, links) bzw. einem Calreticulin-Peptid (CRT(178-188), rechts). In der Bänder-Darstellung von GABARAP ist das β-grasp-Motiv jeweils dunkelblau, die N-terminale Erweiterung hellblau gefärbt. Hydrophobe Seitenketten der Liganden in Kontakt mit den apolaren Bindungstaschen von GABARAP sind explizit gezeigt. Die beiden Bindungsmodi unterscheiden sich deutlich; nur der zweite wurde bislang in physiologischen Interaktionen gefunden.

Für die hexamere ATPase NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor), ein Bestandteil der minimalen Maschinerie zur Fusion von Membranvesikeln, ist ebenfalls eine Interaktion mit GABARAP und seinem Paralog GATE-16 beschrieben worden. We haben ein 3D-Modell für den NSF-GABARAP-Komplex vorgeschlagen (Abb. 3); durch ihre C-terminale Lipidierung könnten GABARAP oder GATE-16 das assoziierte NSF an Membranen verankern.

Weiergräber 4Modell des NSF-GABARAP-Komplexes (Oberflächendarstellung) in axialer (links) und äquatorialer Ansicht (rechts). Die identischen Untereinheiten der hexameren ATPase sind blau und hellgrau gefärbt, die GABARAP-Moleküle orange.

Kürzlich konnten wir zeigen, dass GABARAP mit dem pro-apoptotischen Protein Nix (Nip-like protein x, ein Mitglied der Bcl-2-Familie) interagiert. NMR-Daten deuten darauf hin, dass die Bindung auch hier durch hp1 and hp2 auf der GABARAP-Oberfläche vermittelt wird. Erwähnenswert ist, dass die dreidimensionale Struktur des lipidkonjugierten GABARAP, d.h. der biologisch aktiven Spezies, bisher nicht experimentell bestimmt worden ist. Mittels thiolreaktiver Lipide konnten wir den C-Terminus von GABARAP an Nanodisc-Partikel koppeln und damit die physiologische Membranassoziation imitieren. Unsere NMR-Untersuchungen haben gezeigt, dass das Molekül in diesem Zustand seine native Faltung weitgehend beibehält und die hydrophoben Taschen für die Interaktion mit Zielproteinen zugänglich bleiben. Schließlich haben wir die erste quantitative Untersuchung der GABARAP-Oligomerisierung vorgestellt, basierend auf DOSY-HSQC-Messungen, die das Diffusionsverhalten der Moleküle in Lösung erfassen.

Unsere aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Struktur und Funktion von etablierten, aber auch hypothetischen Komponenten der Makroautophagie; dazu gehören (1) LC3C, ein bislang wenig charakterisierter Vertreter der Atg8-Familie mit bemerkenswerten Eigenschaften, (2) Atg9, das einzige Protein in der zentralen Autophagie-Maschinerie mit mehreren membrandurchspannenden Helices, und (3) das membranverankerte Immunophilin FKBP38, welches die Bcl-2-Funktion über einen noch unbekannten Mechanismus steuert. In einem zellbiologischen Projekt untersuchen wir die bislang unterschätzte Rolle von Phosphatasen in der Regulation der Autophagie.


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