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Nanodiscs ermöglichen das Studium von Membranproteinen

Nanodiscs sind selbstorganisierende Modellmembranen die an Lipoproteine hoher Dichte (HDL: „high density lipoprotein") erinnern. Sie bestehen aus einem kleinen Lipiddoppelschicht-Fragment sowie zwei Kopien eines amphipathischen Gerüstproteins (MSP: „membrane scaffold protein"). Letzteres schirmt den hydrophoben Rand des Membranfragmentes vom umgebenden Wasser ab. Unterschiedliche Gerüstproteine sind in Gebrauch, am häufigsten wird eine biochemisch produzierte Variante des humanen Apolipoprotein A-I verwendet. Eine umfassende Analyse und Optimierung von Nanodiscs erfolgte im Labor von Stephen G. Sligar an der Universität von Illinois in Urbana-Champaign, welcher die Technologie gefördert und verbreitet hat.

NanodiscNanodiscs bestehen aus ~130 Phospholipiden und zwei MSP1 Molekülen (amphipathisches Poly- peptid aus 200 Aminosäuren).

Nanodiscs eignen sich ausgezeichnet zur funktionellen Rekonstitution zahlreicher integraler Membranproteine (IMPs), welche aus natürlichen Quellen isoliert oder rekombinant hergestellt sein können. Nanodiscs ermöglichen die Solubilisierung von Membranproteinen in funktioneller Form und machen die IMPs dadurch einer Reihe biophysikalischer Analysemethoden zugänglich, die bisher nur für lösliche Proteine Anwendung fanden.

Vorteile der Nanodiscs:

  •   Selbstorganisierende Lipoproteine
  •   IMP wird in echte Lipiddoppelschicht rekonstituiert
  •   Lipidzusammensetzung in weiten Grenzen variierbar
  •   Detergenzfreies Modellsystem
  •   Beide Seiten der Membran sind frei zugänglich
  •   relativ geringe Größe (ab ca. 150 kDa und ~10 nm Durchmesser)

Nanodisc2 Entsprechende Mengen Lipid, MSP und Target-IMP werden mit einem geeigneten Detergenz inkubiert. Nanodiscs bilden sich spontan im Zuge der vollständigen Entfernung des Detergenz mittels Dialyse oder spezieller Absorber (links). Einheitliche Nanodiscs werden von überschüssigen Komponenten mittels Gelfiltration getrennt (rechts).

Nanodisc 5

Flüssigkeits-NMR und Nanodiscs

Wir haben gezeigt, dass integrale Membranproteine in Nanodiscs mittels hochauflösender Flüssigkeits-NMR untersucht werden können. Ein Polypeptid, welches die Transmembran- und die zytoplasmatische Domäne des humanen CD4 enthält, wurde in E.coli exprimiert und in Nanodiscs eingebaut. Zweidimensionale 1H, 13C HSQC NMR-Spektren zeigen Korrelations- signale sowohl des 13C-markierten IMP als auch der Lipidmoleküle (natürliche 13C Häufigkeit).

Nanodisc31H, 13C HSQC Spektrum des CD4 Fragmentes in Nanodiscs. Protein- (schwarz) und Lipidsignale (grün) sind sichtbar. Ausgewählte Signale wurden vorläufig zugeordnet (rote Kästchen).

Details:          Glück et al. (2009) J Am Chem Soc 131: 12060-61

Nanodiscs und Plasmonenresonanz

In Nanodiscs verankerte integrale Membranproteine können als Analyt in Oberflächenplasmonenresonanz (SPR: „surface plasmon resonance“)-Untersuchungen eingesetzt werden. Wir bauten ein Fusionsprotein in Nanodiscs ein, welches die Transmembrandomäne von CD4 und die Sequenz des löslichen Proteins Ubiquitin enthält sowie ein N-terminales Decahistidin-Motiv trägt. Die Bindung des Nanodisc-verankerten Fusionsproteins an immobilisierte, monoklonale Antihistidin-Antikörper konnte mit SPR Experimenten charakterisiert werden.

Nanodisc4Im Einzelzyklusmodus gewonnene kinetische Daten reflektieren die Wechselwirkung von immobilisiertem monoklonalen PentaHis Antikörper mit Nanodisc-verankertem His-Ubi-CD4 Fusionsprotein bei zwei unterschiedlichen Oberflächenaktivitäten. Die schematische Darstellung (rechts) illustriert den experimentellen Aufbau.

Reference:          Glück et al. (2010) Analytical Biochemistry 408 (1): 46-52

Arbeitsgruppe König: Biophysik der Wechselwirkung von Proteinen


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