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Konfokale Raman-Mikroskopie

Seit der Entwicklung der Mikroskopie im frühen 17. Jahrhundert hat jeder wesentliche Fortschritt der Mikroskopietechnik zu wissenschaftlichen Durchbrüchen geführt. Deswegen ist es wichtig Mikroskopie auf einer möglichst breiten Basis zu nutzen. Während die meisten unserer optischen Mikroskope Fluoreszenz synthetischer oder gentechnischer Sonden abbilden, können mit einem Raman-Mikroskop die charakteristischen Vibrationsspektren von Molekülen zur Abbildung verwendet werden. Das Raman-Mikroskop kombiniert somit optische Mikroskopie und Raman-Spektroskopie.
In der Raman-Spektroskopie (Abbildung 1) werden durch Laserlicht charakteristische Schwingungen in Molekülen angeregt, was zu rotverschobener Strahlung führt (Stokes-Linie). Diese kann mit einem Spektrometer gemessen und zur Identifikation der Moleküle verwendet werden. Der entgegengesetzte Prozeß, bei dem Schwingungsenergie auf das Licht übertragen wird (anti-Stokes Linie) ist in der Regel viel schwächer und wird daher in dieser Technik nicht verwendet.


Abbildung 1Abbildung 1: Anregung eines Moleküls durch Laserlicht der Frequenz ωi und die charakteristischen Stokes (ωSt)- und anti-Stokes (ωaSt)-Übergänge.

In der Raman-Mikroskopie werden neben dem lichtoptischen Bild einer Probe auch lokal die Raman-Spektren der Probe aufgenommen. Diese ermöglichen direkte Rückschlüsse auf die räumliche und zeitliche Verteilung von Molekülen und deren Konformationen. Da die Raman-Spektroskopie chemisch spezifisch ist, lassen sich mit ihr räumliche und zeitliche Verteilungen von Biomolekülen messen.
Im ICS-7 verwenden wir ein Raman-Mikroskop basierend auf dem alpha 300R der Firma WiTec, das nicht nur ein 2-dimensionales Bild, sondern auch eine konfokale, 3-dimensionale Darstellung erzeugen kann (Abbildungen 2 und 3). Die hohe räumliche Auflösung in alle drei Dimensionen ist bei diesem Gerät mit einer sehr hohen Zeitauflösung, d.h. möglichst viele Raman-Spektren pro Pixel und Zeiteinheit und gleichzeitig geringem Fluoreszenzhintergrund, kombiniert.
Das in unserem Institut verwendete Gerät ist eine Spezialanfertigung, die sowohl aufrechte als auch inverse konfokale Mikroskopie, sowie am Ort der Laserbeleuchtung ebenfalls Kraftmikroskopie (AFM) ermöglicht.


Abbildung 2Abbildung 2: Schematische Darstellung des im ICS-7 verwendeten konfokalen Ramanmikroskops der Fa. WiTec


Abbildung 3Abbildung 3: Fotos des im ICS-7 verwendeten Ramanmikroskops.

Das integrierte Rasterkraftmikroskop dient zur Darstellung der Topographie der durch Ramanspektroskopie abgebildeten Probe, kann aber auch für spitzenverstärkte Ramanspektroskopie (TERS) verwendet werden. Hier wird das relativ zum Fluoreszenzsignal extrem schwache Ramansignal um mehrere Größenordnungen verstärkt.

Abbildung 4 zeigt ein Beispiel eines Lipid-Riesenvesikels bestehend aus dem Phospholipid DOPC in 10 mM Sucrose. Das erste Bild zeigt eine Weisslicht-Aufnahme, das zweite das zugehörige Ramanmikroskopie-Bild. Das gezeigte Spektrum ist ein Differenzspektrum aus der Sucroseumgebung und der Vesikelmembran. Helligkeitsunterschiede auf der Membran entstehen nicht durch Domänenbildung, sondern werden durch Polarisationseffekte hervorgerufen.


Abbildung 4Abbildung 4: Weisslicht- und Ramanbild eines Riesenvesikels aus DOPC in 10 mM Sucrose und das zugehörige Ramanspektrum der Vesikelmembran.

Kontakt:

Dr. G. Beltramo (g.beltramo@fz-juelich.de, 02461 / 61 – 3907)


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