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Institut für Neurowissenschaften und Medizin
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In vitro Techniken: Autoradiographie, Immunhistochemie, Massenspektrometrie

Viele physiologische Mechanismen werden über ein oftmals komplexes Zusammenspiel verschiedener Rezeptoren vermittelt. Auch bei etlichen neurologischen Erkrankungen sind oft viele verschiedene Rezeptortypen beteiligt. Ihre quantitative Darstellung stellt daher einen wichtigen Ausgangspunkt für die Entwicklung von neuen Diagnose- und Therapieverfahren dar.

Quantitative Rezeptorautoradiographie

Wir nutzen die in vitro Rezeptorautoradiographie, um eine Vielzahl unterschiedlicher Rezeptormoleküle an Gewebsschnitten regionenspezifisch und quantitativ zu bestimmen. Dazu werden in der Regel 10 bis 20 µm dicke Hirnschnitte bei ca. -15 °C an einem Cryostaten hergestellt, auf beschichtete Objektträger aufgenommen und getrocknet. Nach Entfernung von Geweberesten und endogenen, möglicherweise konkurrierenden Transmittern werden diese Schnitte mit einer radioaktiven Substanz (Radioligand) inkubiert. Der Radioligand bindet dann an den Zielrezeptor und der überschüssige, d.h. nicht gebundene Radioligand kann anschließend in verschiedenen Waschschritten entfernt werden (siehe Abbildung  1: Vorbereitung und exemplarischer Versuchsaufbau). Nach dem Trocknen der Schnitte kann die Verteilung des Rezeptors durch das Exponieren gegen Film- oder digitale Speicherfolien sichtbar gemacht werden. Durch Vergleich mit histologisch gefärbten Parallelschnitten erfolgt die genaue Identifizierung von Kerngebieten und über einen geeigneten Kalibrierstandard die Quantifizierung der Rezeptorverteilung. In Abbildung 2 ist die Bindung eines spezifischen Liganden für A1-Adenosinrezeptoren dargestellt.

Abb. 1: Vorgehensweise bei der in vitro Autoradiographie.

(A) Herstellung von Hirnschnitten am Cryostat.

(B) Ablauf der einzelnen Versuchsschritte unter Gelblicht (von links nach rechts): Vorbereitung des Gewebes (Vorinkubation), Inkubation mit dem Radioliganden (Hauptinkubation) und drei Waschschritte in Eiswasser.

einzelne Versuchsschritte unter Gelblicht

Definition von Regionen

Abb. 2: Definition von Regionen in einem [3H]DPCPX Autoradiogramm (links) mit Hilfe der Histologie (rechts), um die A1-Adenosinrezeptordichte in spezifischen Hirnregionen zu bestimmen.

In vitro Bindungsstudien bieten den Vorteil, dass durch Umgehung der Blut-Hirn-Schanke und Fehlen (Reduktion) metabolischer Prozesse kinetische Parameter zuverlässig bestimmt werden können. Gerade zur Charakterisierung neuer potenzieller PET-Liganden sind diese Daten aus Bindungsexperimenten an Homogenaten und Gewebsschnitten essentiell. Wir führen sowohl an Hirnschnitten als auch an Hirnhomogenaten Sättigungs- und Kompetitionsstudien durch, um pharmakokinetische Parameter wie maximales Bindungspotenzial (Bmax) und Dissoziationskonstante (KD) wie auch die Selektivität des Radioliganden (über den Einsatz selektiver Kompetitoren) zu ermitteln. Eine typische Sättigungs- und Kompetitionsanalyse zur Bestimmung kinetischer Daten ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abb. 3:

Cell-Harvester zur Durchführung von Sättigungs- und Kompetitionsstudien an Hirnhomogenaten.

(A) Sättigungskurve mit Scatchard-Plot von [3H]CPFPX zur Bestimmung von Bmax und KD.

(B) Kompetitionskurven mit A1-Adenosinantagonisten (CPFPX, DPCPX, N-0840) und A2A-Adenosinantagonisten (ZM 241385).

Sättigungskurve

Immunhistochemie

Auch wenn die Untersuchung von Hirnschnitten mit Hilfe der in vitro Rezeptorautoradiographie eine höhere Auflösung im Vergleich zu in vivo Verfahren wie der PET aufweist, ist eine Unterscheidung unterschiedlicher Zelltypen nicht möglich. Die Untersuchung der Rezeptorverteilung auf zellulärer und subzellulärer Ebene wird daher durch immunhistochemische Verfahren mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Abbildung 4 zeigt exemplarisch die Bindung des A1-Adenosinrezeptorliganden [3H]CPFPX in einem Rattenhirnschnitt und im Vergleich dazu verschiedene immunhistochemisch gefärbte Zelltypen.

Regionenspezifische Bindung von [3H]CPFPX an A1-Adenosinrezeptoren

Darstellung unterschiedlicher Zelltypen

A1-Adenosinrezeptoren

saures Gliafaserprotein als Gliazellmarker

Abb. 4: (A) Regionenspezifische Bindung von [3H]CPFPX an A1-Adenosinrezeptoren. Darstellung unterschiedlicher Zelltypen mittels Immunhistochemie: Neuronaler Nuclei als Neuronenmarker (B), A1-Adenosinrezeptoren (C) und saures Gliafaserprotein als Gliazellmarker (D).

Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppelter Plasmaionenquelle

Ein ebenfalls sowohl an post mortem Gewebe von menschlichen Gehirnen wie auch an experimentellen Modellen einsetzbares Verfahren ist die Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppelter Plasmaionenquelle (LA-ICP-MS), welches eine quantitative Elementanalyse in Gehirnschnitten erlaubt. Im Jülicher Brainmet-Labor wurde diese Technik für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen erschlossen. In der Kooperation fokussieren wir insbesondere auf die Quantifizierung und die systematische Bildanalyse sowie auf neurowissenschaftliche Fragestellungen (siehe Abbildung 5).

Beispiel des Einsatzes der LA-ICP-MS

Abb. 5: Beispiel des Einsatzes der LA-ICP-MS bei der Validierung eines Tiermodells für die Parkinson-Erkrankung. Die Verteilung von Eisen (Fe), Kupfer (Cu) und Zink (Zn) wurde im Hirnschnitt einer Maus gemessen, in welcher einseitig eine Läsion der Substantia nigra durch 6-OHDA-Injektion induziert wurde.

„drug monitoring“


Abb. 6: Kontinuierliche Überwachung („drug monitoring“) der Platinkonzentration mittels Haaranalyse. Es handelt sich um eine Tumorpatientin unter der Therapie mit 4 Zyklen Cisplatin.


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