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Leistungen

Die Gene der zu exprimierenden Proteine werden je nach Zielsetzung, mit oder ohne tag, in Expressionsvektoren kloniert. Der tag kann dabei N- oder C-terminal angefügt werden.

Hänel 1

Übliche tags sind 6x oder 10x His, GST, GB1, Häm-Bindungsstelle des Cytrochrom C, MBP, usw. Die entsprechenden Gene werden oft synthetisch hergestellt, um eine für E.coli optimierte codon usage zu ermöglichen.

Findet die Expression in E.coli statt, wird der Ertrag des exprimierten Proteins optimiert, indem die Temperatur, die Dichte der Bakterien bei Induktion, Konzentration des Induktors und Expressionsdauer variiert werden.

Zur Reinigung der Proteine werden zum einen tag-basierte Reinigungsverfahren, aber auch biochemische Standardverfahren wie Ionenaustauschchromatographie, reversed phase, Gelfiltration usw. angewendet.
Werden die Proteine während der Expression löslich hergestellt, können sie unter nativen Bedingungen gereinigt werden. Entstehen aber während der Expression inclusion bodies, so müssen diese meist unter denaturierenden Bedingen, d.h. in Anwesenheit von 6M Guanidinium-hydrochlorid oder 8 M Harnstoff, gereinigt werden. Im Anschluss einer denaturierenden Reinigung wird das Protein wieder in seine natürlich Faltung überführt.

Dazu müssen in der Regel viele verschiedene Pufferbedingungen und Zusätze getestet werden. Mittels NMR (Protonen- oder HSQC-Spektren (=heteronuclear single quantum coherence) ) oder CD (cicular dicroismus) kann dann der Erfolg der Rückfaltung überprüft werden. Dies ist in der Regel ein iterativer Prozess, der sehr aufwändig und zeitintensiv sein kann und nicht immer erfolgreich verläuft.


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