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Biologie

Proteine sind die molekularen Maschinen in lebenden Organismen. Als Nanomaschinen des Stoffwechsels sind sie in jeder Zelle unseres Körpers unermüdlich aktiv beim Transport, der Synthese, Spaltung und Transformation von Stoffen.

Die Fähigkeit spezifischer Proteine ihre Aufgabe zu erfüllen wird durch die Sequenz ihrer Aminosäuren und deren dreidimensionaler Konfiguration bestimmt sowie durch Konfigurationsänderung in Abhängigkeit von Umgebungsbedingungen.

Neutronenstreuung ermöglicht die Untersuchung der Struktur und Dynamik von Proteinen in wässriger (D2O) Pufferlösung ähnlich zu ihrem “natürlichen” Zustand in der Zelle.

Kleinwinkelneutronenstreuung (KWS) erlaubt die Bestimmung der Proteingestalt in Lösung ohne Artefakte durch Strahlenschäden. Zusammen mit Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) ist auch die Hydratationshülle zugänglich.
Neutron Spinecho-Spectrokopie (NSE) ist ein leistungsfähiges Werkzeug großskalige Bewegungen (Beweglichkeiten) im Zeitbereich zwischen 1-200 Nanosekunden auf verschiedenen molekularen Längenskalen zu beobachten.

Analyse der Streuung liefert die typische (Relaxations)zeit und Amplitude der Bewegungen. Quasi-elastische Neutronenstreumethoden wie die Flugzeitmethode (TOF=time-of-flight) oder die Rückstreumethode (BSS=backscattering spectroscopy) erlauben die Untersuchung der Protonenbewegung im Protein, dessen Aminosäureseitenketten oder der Wasserhülle auf der Sub-Nanosekunden Zeitskala.

Neutronenproteinkristallographie eröffnet die Möglichkeit Wasserstoffatome auch mit atomarer Auflösung in der Proteinstruktur zu lokalisieren.

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Funktionelle kollektive Domänendynamik 


Für die Funktion eines Proteins sind häufig strukturelle Änderungen entscheidend. Diese reichen von lokalen Reorientierungen einzelner Gruppen bis hin zu Rearrangements kompletter Domänen um Einschluss von Substraten, Ausstoß von Produkten oder Rekonfiguration von Domänen in Komplexen zu unterstützen.

In Studien dazu haben wir großskalige kollektive Domänenbewegungen in Alkoholdehydrogenase aus Hefe und ebenfalls in Phosphoglyceratkinase  [1] (siehe Animation) als auch in Immunoglobulinen (IgG) gefunden.

Das Ziel ist ein erweitertes Verständnis des Zusammenhangs zwischen Funktion und Beweglichkeiten in einem Protein durch die Identifikation und Bestimmung des Bewegungsmusters der Domänen in Raum und Zeit durch eine Kombination von Kleinwinkelneutronenstreuung und Neutronenspektroskopie (NSE)  [2].

Intrinsisch ungeordnete Proteine (IUP) und ungefaltete Proteine

Ein große Klasse von Proteinen hat keine definierte Tertiärstruktur. Diese Proteine können strukturierte Teilabschnitte enthalten oder auch nicht, sie habe jedenfalls ein größeres Maß an Konfigurationsfreiheit.
Diese Klasse stellt das traditionelle Struktur-Funktion Paradigma in Frage. Die IUPs falten sich manchmal bei der Bindung an eine aktive Konfiguration, z.B. im Zusammenspiel mit anderen Molekülen. Kenntnis ihrer dynamischen Eigenschaften ist wichtig um den Strukturierungsprozess vor der Funktion, die Dynamik der Faltung oder die Funktion als genuin ungefaltetes Protein zu verstehen.

Man kann zwei Zugängen nutzen, um die zugrundeliegenden Phänomene zu beleuchten. 1. Proteine können entfaltet werden (z.B. durch Temperatur, Druck oder chemisch) mit dem Ziel stabile Zwischenstufen, Übergansregionen oder Unterschiede verschiedener Entfaltungsmechanismen zu untersuchen. 2. Die genauere Betrachtung intrinsisch ungefalteter Proteine. Im Grenzfall sollte sich ein komplett unstrukturiertes Protein wie ein semiflexibles Polymerknäuel verhalten[3].

Die Struktur und Dynamik während des Entfaltungsprozesse und die des entfalteten Proteins werden durch geometrische Einschränkungen wie verbleibende Disulfid-Bindungen (siehe Animation der entfalteten Ribonuclease A mit 4 Disulfid-Bindungen), sowie Ladungen auf den Aminosäuren oder steiferen Regionen, z.B mit erhaltener Sekundärstruktur bestimmt.

Lokale Dynamik

Die Atome in einem Proteinmolekül zeigen neben den kollektiven Domänenbewegungen auch lokale Fluktuationen auf der Subnanosekunden bis Picosekunden Zeitskala. Die entsprechenden Bewegungen sind Schwingungen um die Gleichgewichtskonfiguration der Bindungen, Methylgruppenrotationen, Bewegungen der Seitenketten oder Backbone-Schleifen an der Oberfläche des Proteins. Diese Bewegungen unterscheiden sich in Abhängigkeit von der Zugänglichkeit des Lösungsmittels, der lokalen Geometrie um das Atom und die lokale Stabilisierung, z.B. durch Sekundärstruktur und die generelle Topologie des Proteins.

Für Alkoholdehydrogenase, ein großes tetrameres Protein haben wir diffusive Bewegung von einem Drittel der Protonen mit einer Beschränkung auf 0.7nm und einer etwas geringeren Beweglichkeit als des Wassers im Puffer gefunden. Wir ordnen diese Signal losen Seitengruppen an der Proteinoberfläche, die dem Lösungsmittel ausgesetzt sind zu. Solche Untersuchungen dienen dazu den Zusammenhang zwischen dynamischen Eigenschaften und Topologie zu etablieren.

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Protonierungszustände von Proteinen

Neutronenkristallographie lokalisiert die Wasserstoffatompositionen in Proteinkristallen. Diese fehlen weitgehend in Röntgenstrukturen. Die Braggreflexe von einem Myoglobinkristall (sperm whale) wurden am BioDiff, dem Neutronenkristalldiffraktometer für Proteinkristallographie am MLZ in Garching gemessen. Die Daten zusammen mit der resultierenden Proteinstruktur sind (unten) abgebildet.

Die genuine Zusatzinformation, die Neutronen als Sonde liefern, besteht in der genauen Lokalisierung von Protonen, bzw. deren Austauschbarkeit mit Deuteronen. Damit lassen sich z.B. ungewöhnliche Protonierungszustände von Wasserstoffbrückenbindungen identifizieren oder der Protonierungszustand von Amionsäureseitenketten und die Lösungsmittelstruktur um das Proteinmolekül bestimmen [5].

Um die großen Proteinkristalle, die für diese Methode benötigt werden ziehen zu können, ist detailliertes Wissen zum Phasendiagramm des entsprechenden Proteins notwendig. Auch ist ein besseres Verständnis der Prozesse während der Kristallisation wünschenswert. Neben anderen Techniken, ist die Neutronekleinwinkelstreuung in Kombination mit in-situ DLS (dynamische Lichtstreuung) besonders gut geeignet den Kristallisationsprozess in Echtzeit zu verfolgen. Besondere Anstrengungen werden unternommen die Entwicklung dieser Techniken voranzutreiben, um mehr über die Keimbildung und das Kristallwachstum zu lernen.

Referenzen

[1] R. Inoue, R. Biehl, T. Rosenkranz, J. Fitter, M. Monkenbusch, A. Radulescu, B. Farago, and D. Richter, Biophys J 99, 2309 (2010).

[2] R. Biehl and D. Richter, J. Phys. Condens. Matter 26, 503103 (2014).

[3] A. M. Stadler, L. Stingaciu, A. Radulescu, O. Holderer, M. Monkenbusch, R. Biehl, and D. Richter, J. Am. Chem. Soc. 136, 6987 (2014).

[4] M. Monkenbusch, A. Stadler, R. Biehl, J. Ollivier, M. Zamponi, and D. Richter, J. Chem. Phys. 143, 075101 (2015).

[5] C.M. Casadei, A. Gumiero, C.L. Metcalfe, E.J. Murphy, J. Basran, M.G. Concilio, S.C.M. Teixeira, T.E. Schrader, A.J. Fielding, A. Ostremann, M.O. Blakely, E.L. Raven, P.C.E. Moody, Science 345, 193-197 (2014).

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