Biotechnologie Kolloquium: Dr. Ivan Schlembach (HKI Jena)
Gast: Dr. Ivan Schlembach (HKI Jena)
Titel:
Online-2D-Fluoreszenzspektroskopie gekoppelt mit PARAFAC-Zerlegung als vielseitiger Multiparameter-Sensor für die Bioprozessanalyse
Zusammenfassung:
Die optische Prozessanalytik ist ein wichtiges Instrument für die nicht-invasive Echtzeit-Charakterisierung und Kontrolle von Bioprozessen. Die Messung der optischen Dichte und des rückgestreuten Lichts werden häufig zur Beurteilung des Biomassewachstums eingesetzt. Diese Technologien werden jedoch stark von der Morphologie des Stammes, unlöslichen Medienkomponenten und Luftblasen beeinflusst. Die In-situ-Fluoreszenzspektroskopie ist eine leistungsstarke Technologie zur Messung einer Vielzahl von Variablen, einschließlich des Biomassewachstums, des Substratverbrauchs und der Produktbildung, die von diesen Störungen weit weniger beeinflusst wird. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, hochauflösende 2D-Anregungs-Emissions-Matrizen zu erfassen, eine präzise Zerlegung und Identifizierung von Fluorophoren in komplexen Systemen, selbst bei erheblicher spektraler Überlappung. Dies kann mit Hilfe der parallelen Faktorenanalyse (PARAFAC) geschehen, einer Tensorzerlegungsmethode, die in der Lage ist, gemischte trilineare Spektren in ihre einzelnen Komponenten zu zerlegen, ohne dass dafür Vorkenntnisse erforderlich sind. PARAFAC liefert Anregungs- und Emissionsspektren der Komponenten zusammen mit ihren Konzentrationsprofilen und erhöht die Empfindlichkeit erheblich. Dies ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Autofluoreszenzdynamik, die z. B. zur Charakterisierung des zellulären Redoxzustands, von Stoffwechselschaltern, der Aminosäureaufnahme und der Proteinproduktion genutzt werden kann. Darüber hinaus kann die Spektralanalyse des rückgestreuten Lichts ergänzende Informationen liefern.
Trotz dieser Vorteile wird die Fluoreszenzspektroskopie in der routinemäßigen Bioprozessanalyse nur selten eingesetzt, vor allem weil es an standardisierten Geräten für Rührkesselfermenter fehlt. Hier wurde ein neuartiger und flexibler Aufbau für die Online-Fluoreszenzspektroskopie in Rührkesselfermentern entwickelt, der es ermöglicht, ein Standard-Tischfluoreszenzspektrometer mit verschiedenen Bioreaktoren vom Labor- bis zum Produktionsmaßstab zu verbinden.
Zur Demonstration der Möglichkeiten dieses Systems wurde ein Prozess zur Herstellung von Cellulase unter Verwendung des industriell weit verbreiteten Pilzes Trichoderma reesei gewählt. Der Prozess wurde in einem trüben mineralischen Medium mit festen Zellulosepartikeln als Substrat durchgeführt, was die Robustheit gegenüber Trübungen verdeutlicht. Um die analytische Leistung in einem komplexen Gemisch mit vielen Fluorophoren zu demonstrieren und die rekombinante mit der Autofluoreszenz zu vergleichen, wurde ein mit mCherry markierter Stamm verwendet.
Die Autofluoreszenz von Tryptophan diente als hervorragendes Signal, um die Bildung von Biomasse zu verfolgen, während gleichzeitig viele andere bekannte und unbekannte Autofluoreszenzverbindungen aufgespürt werden konnten. Das System erwies sich auch als hervorragend vergleichbar mit Biolector-Fluoreszenzmessungen im kleinen Maßstab. Die Arbeit unterstreicht das Potenzial der Online-Fluoreszenzspektroskopie als eine leistungsfähige und bisher unterrepräsentierte PAT-Technologie, die es ermöglicht, eine Vielzahl von Faktoren mit einem einzigen Sensor zu bewerten.