Mikroskopie

Mikroskopie

"Erst viel später bin ich auf Formalinpräparate verfallen und habe mit Befriedigung feststellen können, dass Formalinfixierung die Doppelbrechung der markhaltigen Nervenfasern nicht verändert, dass wir also auch in Formol gehärtete und konservierte Nervenfasern … durch das Polarisationsmikroskop untersuchen und eventuelle krankhafte Veränderungen derselben wahrnehmen können."

 (K. Brodmann, J Psych Neurol, 1903, p.212)

Nach der Präparation des zu untersuchenden Hirngewebes erfolgt der Schneideprozess in einem Großschnitt-Kryostat. Bei −50 °C werden darin 50 Mikrometer dünne Schnitte des Gehirngewebes erstellt. Jeder dieser Schnitte wird auf einen Glasobjektträger überführt und bis zur Weiterverarbeitung zunächst bei -80 °C gelagert.

Eine hochauflösende Kamera, die oberhalb des Kryostaten montiert ist, nimmt vor jedem Schneidevorgang ein Bild von der Gehirnoberfläche auf. Diese sogenannten Blockface-Bilder sind von entscheidender Relevanz für die spätere Rekonstruktion des Gehirns.

Um eine konstante Pixelgröße und Fokussierung bei der Bildaufnahme zu gewährleisten, wird die Blockface-Kamera nach jedem Bild automatisiert über eine motorisierte z-Achse um die jeweilige Schnittdicke (z.B. 50 µm) in Richtung Gehirnblock verfahren. Für eine möglichst homogene Beleuchtung sorgen dabei zwei LED-Flächenleuchten, die links und rechts neben der Kamera positioniert sind.

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Die ungefärbten histologischen Gehirnschnitte werden mit verschiedenen polarimetrischen Setups gescannt, die von uns entwickelt und als 3D Polarized Light Imaging (3D-PLI) etabliert wurden. Der optische Aufbau dieser Mikroskope besteht prinzipiell aus zwei rotierbaren linearen Polarisationsfiltern, einer Viertelwellen-Verzögerungsplatte und einer grünwelligen LED-Lichtquelle. Das Messprinzip beruht darauf, dass myelinisierte Nervenfasern optisch doppelbrechend sind. Durchdringt nun polarisiertes Licht dieses doppelbrechende Gewebe, wird sein Polarisationszustand abhängig von der Orientierung der Myelinscheiden (und damit der Nervenfasern) verändert. Diese Polarisationsänderung wird in den Mikroskopen detektiert und ermöglicht über eine pixelgenaue Analyse die Rekonstruktion der dreidimensionalen Nervenfaserrichtungen.

Mit dieser Methode können somit einzelne Fasern und Faserbahnen kontrastiert und ihr dreidimensionaler Verlauf über viele aufeinander folgende Gehirnschnitte hinweg untersucht werden.

Unsere polarimetrischen Technologien wurden und werden kontinuierlich weiterentwickelt und an die Anforderungen der automatisierten High-Throughput-Large-Scale-Polarisationsmikroskopie angepasst. Unser aktuellstes 3D-PLI-Mikroskop mit Tilt-Option (LMP3D, Taorad) ermöglicht zusätzlich zum bisherigen Messprinzip auch eine präzise Verkippung des Beleuchtungswinkels. Die gemessenen Signalunterschiede in diesen zusätzlichen Tiltmessungen ermöglichen eine noch genauere Interpretation der Messung und eine eindeutigere Bestimmung der Inklination der Nervenfasern. So kann neben der Faserrichtung in der Schnittebene (Direktion) auch der Winkel der Fasern aus der Schnittebene heraus (Inklination) rekonstruiert werden.

Auf High-performance Computing basierende Signal- und Bildverarbeitung sowie Simulationsansätze ermöglichen schließlich eine verlässliche Interpretation und Visualisierung der Faserarchitektur.

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Beim Scattered Light Imaging (SLI) wird Gehirngewebe aus verschiedenen Richtungen beleuchtet und das gestreute Licht mit einer Kamera aufgenommen. Nervenfasern können vereinfacht als lange, zylinderförmige Strukturen betrachtet werden. Entlang ihrer Längsachse wird nur wenig Licht gestreut, senkrecht dazu hingegen deutlich mehr.

Durch die Variation des Beleuchtungswinkels entstehen winkelabhängige Streulichtprofile. Aus diesen Profilen lässt sich die Orientierung der Nervenfasern in der weißen Substanz rekonstruieren. Dafür werden verschiedene Beleuchtungsmuster auf einem LED-Display angezeigt. Ein Vorteil von SLI ist, dass auch sich kreuzende Nervenfasern erfasst werden können, da sich die Streulichtsignale linear überlagern.

Da das gemessene Licht jedoch sehr schwach ist und große Datenmengen entstehen, entwickeln wir optimierte Beleuchtungsformen. Ähnlich wie bei einem QR-Code wird Information in die Beleuchtung kodiert, indem die Probe aus mehreren Richtungen gleichzeitig beleuchtet wird. Dadurch steigt die gemessene Lichtintensität, wodurch sich die Messzeit verringert und die effektive Winkelauflösung der Nervenfaserorientierungen verbessert wird.

Publikation: Optimierung der Beleuchtung

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Im Gegensatz zur konventionellen, intensitätsbasierten Mikroskopie ermöglicht die digitale holographische Mikroskopie (DHM) die Messung des vollständigen komplexwertigen Lichtfeldes. Neben der Intensität kann dadurch auch die Phase des Lichtfeldes bestimmt werden, die zusätzliche Informationen über die Probe enthält.

Die Holographie nutzt dafür die Interferenz zwischen einer durch die Probe modulierten Lichtwelle und einer unmodulierten Referenzwelle. Unter der Annahme einer weitgehend transparenten Probe lassen sich daraus Amplituden- und Phaseninformationen rekonstruieren.

In unserem Aufbau verwenden wir In-line-Holographie mit einer sogenannten Doppelseitenband-Filtermethode. Dadurch wird eine möglichst einfache und stabile Messung ermöglicht, da holographische Verfahren sehr empfindlich gegenüber äußeren Einflüssen sind. Realisiert wird dies mit einem Spatial Light Modulator (SLM) und linearen Polarisatoren, die hinter der Probe angeordnet sind.

Da DHM sowohl die Amplitude als auch die Phase des Lichtfeldes misst, können digitale Filter direkt auf das rekonstruierte Lichtfeld angewendet werden. So lassen sich beispielsweise Dunkelfeld- oder Phasenkontrastbilder rechnerisch erzeugen. Analog zur optischen Modulation in klassischen Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopen erfolgt diese Filterung im Fourier-Raum.

Dadurch kann der Kontrast gezielt an bestimmte Gewebebestandteile angepasst werden. Strukturen, die in konventionellen Intensitätsbildern nur schwach sichtbar sind, lassen sich so deutlicher hervorheben und für weiterführende Analysen, etwa Zellsegmentierung oder Zellklassifikation, besser nutzbar machen.

Außerdem ermöglicht die Aufnahme des vollständigen Lichtfeldes, also von Amplitude und Phase, die digitale Berechnung der Lichtausbreitung in 3D. Dazu wird die Helmholtz-Gleichung, welche die Ausbreitung elektromagnetischer Wellen beschreibt, numerisch gelöst. Durch die Anwendung von Autofokuskriterien lässt sich anschließend bestimmen, in welcher Tiefe makroskopische Strukturen, etwa dicke Faserbündel, liegen.

Auf diese Weise können räumlich überlagerte Strukturen besser voneinander getrennt werden. Dies hilft insbesondere dabei, Kreuzungen von Faserbündeln aufzulösen und die dreidimensionale Organisation von Hirngewebe genauer zu untersuchen.

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