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Die akzessorischen Proteine des SARS-Coronavirus

Bei dem SARS-Coronavirus (SARS-CoV) handelt es sich um ein behülltes Einzel(+)strang-RNA-Virus, welches eine Genomgröße von annähernd 30 kb besitzt. Die von den 14 offene Leserahmen (ORF) kodierten Proteine können allgemein in drei Gruppen eingeordnet werden. Die erste Gruppe umfasst die Genprodukte des Gens 1, welches in zwei offene Leserahmen untergliedert ist und zunächst durch eine Verschiebung des Leserasters während der Transkription ein langes Polypeptid bildet. Durch anschließenden proteolytischen Verdau entstehen daraus 16 Proteine, die vor allem für die Replikation des Virus verantwortlich sind. Die zweite Gruppe wird aus den so genannten strukturellen Proteinen (spike, envelope, nucleocapsid, membrane) gebildet, die eine wichtige Rolle beim viralen Assambly spielen und wie die Proteine der ersten Gruppe charakteristisch für die Coronaviren sind. Bei der dritten Gruppe handelt es sich um acht akzessorische Proteine, die virusgruppenspezifisch sind und deren Funktionen noch weitestgehend unbekannt sind.


Das Schwere Akute Atemwegssyndrom ("severe acute respiratory syndrome", SARS) wurde erstmals im November 2002 in der chinesischen Provinz Guangdong beobachtet. Der SARS-Erreger war ein bis zum Ausbruch der Epidemie unbekanntes Coronavirus, das im Folgenden als SARS-assoziiertes Coronavirus (SARS-CoV) benannt wurde.

 

Das akzessorische Protein 7a des SARS CoV - Strukturbasierte Vorhersage der Funktion

 

Wie bereits beschrieben, zeigen die akzessorischen Proteine des SARS-CoV keinerlei Sequenzhomologien zu bereits bekannten Proteinen in Datenbanken. Demzufolge ist es nicht möglich, eine Vorhersage der Funktion auf der Grundlage eine Sequenzhomologie eines ähnlichen Proteins mit bekannter Funktion vorzunehmen. Strukturbasierte Vorhersage der Funktion basierend auf Sequenzähnlichkeiten zu Proteinen mit bekannter Funktion wurde bereits vielfach erfolgreich angewendet und wurde von uns im folgenenden auf das akzessorische Protein 7a des SARS CoV angewendet.


Bestimmung der Lösungsstruktur von Protein 7a:

Das akzessorische Protein 7a (siehe Abb. 1) ist ein Typ I Transmembranprotein bestehend aus 122 Aminosäuren. Es besitzt eine N-terminale Signalsequenz (AS 1-15), die während der Translation am endoplasmatischen Reticulum (ER) abgespalten wird, eine Ectodomäne (AS 16-98), eine transmembrane Helix (AS 99-117) und eine kurze cytolasmatische Sequenz von 5 Aminosäuren. Diese carboxy-terminale Sequenz (KRKTE) stellt eine funktionelle Rückholsequenz für das ER dar. Den größten Teil des Proteins stellt die hydrophile Ectodomäne dar, die in das Lumen von ER und Golgi-Apparat oder auf der Oberfläche der Zellmembran oder des Viruspartikels lokalisiert ist.

SARS 1Die Reste 1-65 zeigen zwei gut definierte beta-Faltblattstrukturen, die sandwich-förmig angeordnet sind und über zwei Disuldfidbrücken stabilisiert werden. Das größere beta-Faltblatt besteht aus 4 Strängen (A, G ,F , C), das kleinere aus 3 Strängen (B, E, D). Alle beta-Stränge sind antiparallel angeordnet, mit Ausnahme der Stränge A und G, die parallel vorliegen. Die Gesamtstruktur wird als Immunglobulin-like bezeichnet.

Mit den Raumkoordinaten des Proteins wurde die Strukturdatenbank pdb (protein data bank) durchsucht (verwendete tools: VAST und Dali), um nach strukturell ähnlichen Protein zu 7a zu suchen. Dabei wurden die D1-Domänen von ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) und ICAM-2 als die zu 7a ähnlichsten Proteine identifiziert. Ein bereits bekannter Ligand von ICAM-1 und ICAM-2 ist LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1). An dieser Interaktion ist die D1-Domäne von ICAM-1 und die I Domäne von LFA-1 beteiligt, deren Bindungsinterface der Komplexstruktur (Shimaoka et al. 2003) entnommen werden kann. Basierend auf der großen Ähnlichkeit von 7a zu ICAM-1 wurde von uns eine Bindungsaktivität für 7a an die I-Domäne von LFA-1 vorgeschlagen.

 

Die Interaktion zwischen 7a und LFA-1:

Um die Vorhersage experimentell zu bestätigen, wurden Experimente durchgeführt, bei denen zum einen die Bindung von rekombinantem 7a an LFA-1 exprimierende Jurkat Zellen (T-Zellen) und zum anderen die Bindung von rekombinantem 7a in in vitro-Bindungsassays an rekombinant hergestellter I-Domäne untersucht wurde.

Die Ergebnisse zeigten, dass rekombinantes 7a spezifisch an LFA-1 bindet, welches auf der Oberfläche von Jurkat Zellen exprimiert wird. Die Bindung ist sowohl konzentrationsabhängig als auch sättigbar und wird verstärkt, wenn die Zellen unspezifisch mit Phorbolester (PDBu) stimuliert werden. Von anderen Arbeitsgruppen wurde gezeigt, dass LFA-1 in einer aktiven und einer inaktiven Form existiert. Die aktive Form kann künstlich u.a. durch Phorbolester induziert werden, wobei konformationelle Veränderungen in LFA-1 zu einer gesteigerten Bindungsaffinität gegenüber ICAM-1 führen. Von der rekombinanten WT I-Domäne von LFA-1 ist bekannt, dass sie die nicht-aktive Konformation darstellt und ICAM-1 nur mit niedrige Affinität bindet.

SARS 2

Shimaoka et al. 2003 hatten eine Mutante (K287C/K294C) der I-Domäne hergestellt, bei der durch Einführung einer Disulfidbrücke der aktivierte Zustand nachgeahmt und die Affinität gegenüber ICAM-1 10.000fach erhöht wird. In einem 7a-ELISA (siehe Abb. 2), bei dem rekombinante I-Domäne (WT/ Mutante) gekoppelt und 7a in steigenden Konzentrationen dazu gegeben wurde, konnten wir zeigen, dass die Mutante (geschlossene Kreise), im Vergleich zum Wildtyp (offene Kreise), signifikant stärker an 7a bindet.

Arbeitsgruppe Hänel: Virale Proteine


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